2014-05-31

El Modelo de Matzke (Parte II) —Sean. D. Pitman

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El filamento “simple”.

Una vez dada la existencia del TTSS, el paso siguiente sería la adición de un filamento. Matzke y muchos otros sostienen que filamentos simples a base de proteínas son fáciles de hacer —dando como ejemplo la polimerización de la hemoglobina en pacientes con anemia drepanocítica, que es el resultado de una única mutación puntual. Este modo de pensar subestima los requisitos más específicos que se necesitan para formar un filamento funcional de cualquier tipo.

Por ejemplo, las partes de un filamento aleatorizado, como las que forman la “hoz” de hemoglobina, son muy propensas a agregarse en grumos o hebras largamente enredadas antes de que sean transportadas a través de cualquier tipo de poro a la superficie exterior de la célula. Obviamente eso no sería útil. Además, incluso si tales monómeros de filamento se hacen llegar a la superficie exterior sin que ocurra una aglutinación, estos tienen que adherirse preferentemente al lugar correcto. Eso requiere de características vinculantes bastantes específicas. ¿Cuáles son las probabilidades de que un monómero de filamento al azar adquiera también tales características de unión? Estas posibilidades se traducen en una enorme cantidad de tiempo —en promedio.

Hay un montón de otros problemas potenciales para producir y organizar monómeros de filamentos. ¿Qué sobre la degradación? ¿Qué sobre el transporte a través del canal y la selectividad del mismo? ¿Qué sobre pegarse a la parte interior del canal y la obstruir la vía? ¿Qué pasa si el filamento terminó formando un núcleo sólido en lugar de un núcleo hueco? ¿Cómo harían el resto de los monómeros de filamento para adherirse uno a uno en el extremo del mismo? ¿Qué si el extremo no se encuentra controlado y tapado por un tipo diferente de proteína que coloca cada pieza nueva de proteína en el lugar correcto? ¿Cuáles son las probabilidades de que cualquiera de los filamentos originados vía evolución que se adhiera a la maquinaria de exportación genere un beneficio en un ambiente determinado, incluso aunque fuese un "simple" filamento de anclaje?

No sólo que las partes cada vez más y más específicas del filamento tienen que pegarse entre sí  como con el aparato de secreción de la manera correcta, sino que deben formar un filamento cuyo extremo distal es capaz de pegarse a otra cosa que no sea en sí la propia superficie de la bacteria. Por encima de todo lo demás, eso puede ser poco difícil de conseguir. ¿Cuáles son las probabilidades de que un gen capaz de codificar estas proteínas especializadas de filamento simplemente surja para que luego su producto sea secretado de forma específica por un poro de transporte activo ya existente?

El pilus P “simple”.

Con fin de dar una respuesta a esta pregunta, primero vamos a considerar lo que se necesita para producir incluso el filamento bacteriano funcionalmente más “simple” —el pilus P.

El pilus P funciona como un ancla de unión entre las células bacterianas y otras células. Se trata de un filamento hueco y delgado que adelgaza más cerca del extremo. En ese lugar hay una proteína que se une específicamente a ciertos tipos de moléculas de azúcar en ciertos tipos de células (como las células del riñón). A pesar de que este pilus es en realidad tan simple como aparenta y que su función parece ser bastante trivial, se encuentra codificado por 10 o 11 genes —esa es también la cantidad aproximada de genes que codifican para el complejo del sistema de secreción de tipo III (TTSS). La porción proximal gruesa está formada por proteínas PapA, la porción distal más delgada por proteínas PapE, y el extremo por PapG (la "adhesina" específica que se une a los azúcares). También hay un adaptador, PapF, que une a PapG y PapE, y otro adaptador, PapK, que une a PapE con PapA. [14] En total, 5 proteínas diferentes que se unen en un orden muy específico. ¿Cómo se logra ese orden?

Bien, esto se realiza a través de una complicada interacción con proteínas "chaperonas". Pero primero, la célula tiene que construir una vía de exportación multiproteica denominada la ruta Sec, para porder volcar el material del citoplasma en el espacio periplasmico. El desafío para aquellas bacterias gram-negativas "que quieren" hacer crecer un pilus es conseguir que el filamento logre penetrar la membrana externa. Esto requiere de una cierta coordinación fantástica. Primero, todas las subunidades del pilus se exportan en un estado no plegado hacia el periplasma a través de la ruta Sec para luego plegarse. Sin embargo, si esto se deja sin ningún control, ellas formarían acumulaciones desorganizadas. Por lo tanto, se requiere de una proteína chaperona, PapD, para evitar este problema y para ayudar en el pliegue de estas proteínas para que adquieran la conformación correcta, y lo realiza a través del mecanismo DSC (donor strand complementation). Las partes del filamento, por sí mismas, son muy inestables y nunca se pliegan correctamente. Y la proteína PapD no tiene ninguna otra función conocida.

Lo que ocurre después es que el complejo subunidad-chaperona  interactúa con un canal proteico en la membrana externa, conocido como PapC. Este canal es lo suficientemente grande como para que la extremidad distal del filamento pueda pasar, pero no la parte proximal. PapD, la chaperona, le cede la subunidad de pilus a la PapC, que a su vez ayuda en la unión de esta con el filamento en crecimiento donde cada subunidad contribuye con una cadena a fin de estabilizar y completar el pliegue de su vecina.

Por supuesto, existen numerosas subunidades estructurales que participan en la funcionalidad del pilus P. La fimbria P (o pili P) tiene mayor cantidad de subunidades estructurales en la bacteria E. coli (con 9 subunidades estructurales). Sin embargo, las fimbrias del tipo 1 se construyen a partir de 7 subunidades, y las fimbrias YQI, recientemente caracterizadas, muestran una organización genética en la que participan solo 4 subunidades estructurales [19]. Tenga en cuenta también que la E. coli presenta numerosos operones fimbriales con un número variable de subunidades estructurales. Sin embargo, "todas las adhesinas fimbriales comparten una organización genética común, en la que los genes reguladores de adhesina preceden al gen de la subunidad mayor, que es seguido por la chaperona periplásmica, una estructura ordenadora (“ujier”) en la membrana externa, y por último los genes de adhesina. Esta organización del grupo de genes se ve en las fimbrias del tipo 1 (fim), fimbrias S (sfa), fimbrias F1C (foc) y las fimbrias reconocedoras del antígeno Dr (dra). La organización del pack de genes de la adhesina yqi difiere en el hecho de que las posiciones de la proteína “ujier” y chaperona se encuentran invertidas, lo que también ocurre en el caso del grupo de genes de la adhesina pap de las fimbrias P, aunque el motivo de esto, sea funcional o biológico, todavía no se ha aclarado". [19]

En pocas palabras, todas las fimbrias o pili bacterianos comparten los mismos elementos indispensables y misma programación estructural indispensable —que es bastante compleja, incluso en los casos más simples que se conozcan de fimbrias funcionales.

Así, incluso algo tan relativamente "simple" como la construcción de un pilus parece bastante complicado en comparación con el paso evolutivo que se ha propuesto en la evolución del filamento. Es muy difícil producir un filamento "útil" —al menos eso es lo que parece. Pero, digamos que un filamento como ese pudiera evolucionar de alguna manera. ¿Cómo va a evolucionar hacia un flagelo? Un flagelo tiene que ser capaz de secretar proteínas a medida que está siendo construido. El problema es que no se ha demostrado que algún pilus P pueda secretar proteínas —quizás debido al tamaño pequeño del canal o la falta de una fuente de energía para el bombeo de proteínas hacia el exterior. En cualquier caso, un pili como ese incluso sería muy diferente a un flagelo en un aspecto muy importante. El pili se construye de arriba hacia abajo, donde cada nuevo monómero que se agrega empuja hacia arriba y hacia afuera al pilus existente. Los flagelos, por el contrario, se construyen de abajo hacia arriba; se añade cada nuevo monómero al extremo distal o punta a medida que va creciendo hacia el exterior sobre el flagelo existente (vea la siguiente animación de la biosintesis del pili y comparela con la animación del ensamblaje flagelar provista en el post anterior).



El fallecido Robert Macnab, ex-profesor de biofísica molecular y bioquímica de la Universidad de Yale, quien también estudió a los flagelos, señaló que el mecanismo de construcción del flagelo es "un proceso mucho más sofisticado que cualquier otro que pudiéramos haber imaginado alguna vez" [8] Mas tarde llegaría a admitir: "imaginamos que no sería posible que el sistema funcione si tuviese una complejidad mucho menor." [9]

El filamento flagelar

Entre las bacterias existe un género interesante que carece de motricidad, conocido como Shigella; tiene genes flagelares, pero no sintetiza ningún flagelo. Algunas cepas de Shigella tienen menos de estos genes que otras cepas, pero en ciertas cepas, el único gen que falta es el gen FliD. El gen FliD codifica para la proteína cap que se coloca en la punta del filamento. Sin tal proteína de cubierta denominada FliD, los monómeros de flagelina (FliC) que forman el filamento se pierden. Además de eso, sin la FliD, las partes FliC simplemente no se ensamblarán correctamente (ver animaciones de Keiichi Namba et . Al. [12]). Esta proteína cap luce como un anillo pentagonal que se inserta encima del filamento flagelar hueco. Cada una de las 5 partes del pentámero FliD tiene un apéndice a modo de pata que apunta hacia abajo y se relaciona estrechamente con los monómeros de filamento. Sin embargo, existe una ligera falta de coincidencia. Esta cubierta tiene 5 patas, mientras que el extremo del filamento presenta 5,5 subunidades de flagelina en su circunferencia. Por lo tanto, siempre queda un poco de grieta en un punto entre la cubierta y el filamento. La siguiente subunidad se agrega justo en ese punto del flagelo en crecimiento. A medida que la subunidad va pasando por el lugar abierto, la cubierta gira de manera que un nuevo punto se abre al lado del que se acaba de llenar. Así que, como la cubierta da vueltas y vueltas, a 10 revoluciones por segundo, nuevos monómeros de flagelina (FliC) se añaden uno a uno, en total, 50 por segundo [8].

Lo más interesante de todo esto es que los extremos de las subunidades de flagelina se encuentran en un estado no-plegado —así es como viajaron a través del conducto del filamento hueco. Una de las razones de esto es que la flagelina plegada logra cierta torsión en el medio que hace que sea demasiado grande como para viajar a través del tubo. Por sí mismas, las subunidades de flagelina no pueden plegarse correctamente. Por lo tanto, se requiere la cubierta FliD tanto para plegar como para colocar los monómeros de flagelina. Es otras palabras, es un tipo de chaperona. Además, la zona hueca justo debajo de la cubierta es de aproximadamente el doble del tamaño que el resto del tubo y lo suficientemente grande como para permitir el plegado de una subunidad monomérica. El giro de la tapa combinado con interacciones proteína-proteína favorables proporciona la energía para este proceso de plegado —ya que no hay ATP involucrado. [8]

En breve, sin esta cubierta altamente especializada, las unidades de flagelina no pueden en absoluto auto-ensamblarse para formar un filamento tan ordenado. Y ni la proteína cap ni los monómeros de flagelina tienen cualquier otra función celular. ¿Cómo es que la proteína cap se coloca en la posición correcta en el extremo del filamento y como es que otras proteínas cap ya no son enviadas por el tubo una vez hecho esto? Una vez más, se requiere una chaperona específica para el montaje de la cubierta y la prevención de la agregación prematura.

Para contrarrestar este argumento, se hace la aseveración de que debido a que las unidades de proteína tubular flagelar, FliL y FliK, no necesitan una cubierta para su montaje adecuado, la adición de una cubierta para este sistema consistió en una modificación evolutiva tardía con el fin de mejorar la velocidad y la eficiencia. [1] Un problema potencial para este argumento es que FliL y FliK son solo proteínas de unión. Su función es unir parte del gancho del flagelo (FlgE) con el resto del flagelo (FliC). Por sí mismas, no forman la estructura flagelar. Incluso si lo hicieran, esto no explicaría cómo las subunidades de flagelina (FliC) podrían auto-ensamblarse sin una proteína cap o cómo podrían haber evolucionado sin la co-evolución de tal cubierta, que es muy específica —requiriéndose un gran número de cambios de residuos altamente especificados para la obtención de la mínima ventaja selectiva.

Pero ¿qué sucede con la hipótesis de la "primera cubierta" en la que la proteína cubierta evoluciona, debido a sus propiedades adhesivas, y es mejorada por posterior evolución de las proteínas del pilus que la terminan llevando hacia el exterior de la célula? De nuevo, ¿en cuánto tiempo podría un monómero de proteína flagelar llegar a ser lo suficientemente específico como para interactuar con una cubierta, y de una manera tan compleja?

Las explicaciones de Matzke no consiguen ser más detalladas que lo que hemos venido viendo. Si estos pasos evolutivos eran tan fáciles de atravesar, podrían ser fácilmente probados en el laboratorio. Sólo se tendría que eliminar en una bacteria el gen FliC que codifica para la flagelina y observar si sus descendientes van a evolucionar de nuevo un flagelo con la cubierta “preestablecida”. Hasta donde sé, no ha habido experimentos como este que hayan tenido éxito. Como se ha mencionado anteriormente, una misma cosa es cierta para las bacterias que no tienen el gen cap FliD, como Shigella. Estas bacterias pueden tener todos los otros genes flagelares, pero han perdido el gen cap —y no pueden producir un flagelo ni han re-evolucionado el gen cap. ¿Por qué será?

Motorizar al Flagelo

Ok, digamos que de alguna manera una colonia primitiva de bacterias fue capaz de desarrollar algún proto-TTSS y un proto-filamento en donde cada sistema fue independientemente funcional de alguna forma selectivamente benefica. Ahí es en donde Matzke argumenta que sería cosa muy fácil juntar esos dos sistemas para obtener la motilidad flagelar.

Antes de analizar esto, hagamos un poco de revisión. Recuerde que el motor flagelar está dividido en dos unidades básicas —el estator y el rotor. El estator se compone de las subunidades MotA y MotB (cada una compuesta por aproximadamente 300 aminoácidos). El rotor se compone de FliM (~330 aa), FliN (~130 aa), y la FliG (~330 aa). Estos 3 componentes del rotor también están involucrados en la construcción del flagelo. El anillo-C, formado por esos componentes, actúa como una especie de copa de medición que determina el tamaño del gancho. Lo que ocurre es que aproximadamente 120 monómeros de gancho se unen a FliM, FliN y FliG, (en  4 sitios de unión en cada uno). Cuando se saturan todos los sitios de unión, todos los monómeros se liberan a la vez y se forma un segmento de "gancho" de una longitud específica. Después de que los monómeros de gancho abandonan el anillo C, otra proteína entra y convierte el anillo en C de un secretor de proteínas del gancho a un secretor de proteínas de flagelina. La especificidad del anillo C cambia con respecto a qué tipo de monómeros se acepta.

De esta manera, la FliG es importante en la construcción del flagelo en el sentido de que se precisa de sus 200 residuos N-terminales. De hecho, si uno se divide la cadena de 331 aa de la FliG en segmentos de 10 aa cada uno, mutaciones deletéreas en los segmentos 11, 13, 16, 17, 20, 21 y 27 dan como resultado la no-formación de flagelo adecuado y, obviamente, eso afecta a la función de motilidad. También, aquellas bacterias con mutaciones en los segmentos 1, 3, 12, 14, 15, 22, 23, y 26 de la FliG son completamente "no-flageladas" [10].

Eso significa que el planteo de Matzke de que FliG, como parte del complejo de proto-secreción, es "retenido sólo con el fin de estabilizar/sostener al complejo secreción co-adaptado y al anillo FliF, y [es] por lo contrario, vestigial " es un completo disparate. La FliG es vital para la secreción y no tiene nada que ver con la estabilización de FliF (FliF ha demostrado ser bastante estable de forma independiente). Es sólo que FliF sin FliG no puede formar un flagelo adecuado.

Por supuesto, la proteína FliG (sin contrapartes homólogas significativas por cierto) es también la sub-parte responsable de convertir la fuerza proto-motriz en fuerza de torca para el movimiento de rotación del flagelo. Los ~100 residuos C-terminales parecen ser necesarios para esta función. Además, mutaciones específicas en los segmentos 10, 18, 19, 24, 25, 28, 29 y 31 forman flagelos, pero los tales están paralizados. [10].

En cuanto a función rotativa, FliM y FliN son responsables de la conmutación —el movimiento de una dirección a la otra—, no de la generación de fuerza de torsión. Sin embargo, FliM y FliN siguen siendo necesarias para la construcción del flagelo.

Ahora, vamos a hablar de FliF (el anillo MS de ~ 550 aa. que forma el complejo del poro de la membrana) por un momento. La proteína FliF no tiene homólogos conocidos fuera del TTSS (que se cree que ha evolucionado desde el sistema flagelar —no al revés). Incluso teniendo en cuenta su existencia en una proto-forma, explicar cómo un proto-flagelo/filamento podría atascarse a ella de una forma beneficiosa es todo un reto. El ensamblaje de los filamentos incluso más simples es bastante complicado, como se describió anteriormente. Diversas proteínas chaperonas están involucradas en llevar monómeros específicos a su lugar justo en el momento adecuado y también de plegarlos y unirlos. La construcción de un pilus aparentemente simple es extremadamente compleja. La construcción de un flagelo hueco que se forma añadiendo monómeros al extremo distal es extraordinariamente complicado.

Teniendo en cuenta estos hechos presentados hasta el momento, tengo sólo unas pocas preguntas. Matzke sugiere que FliG no necesitaba evolucionar con FliF como parte del aparato de exportación. ¿Cómo se explica esto ya que FliG es requerida para la construcción del flagelo? Si FliG no evolucionó con FliF, entonces ¿sería necesario que se uniera fuertemente a FliF de una manera tal que supera las fuerzas rotación de la FliG, y que también lo haga de una forma en que ayude en la construcción del flagelo? No sólo que la FliG debe unirse a la FliF, sino que también tiene que tener especificidad para cierto tipo de monómero de filamento. A lo que quiero llegar es que sin la afinidad especifica de la FliG por la flagelina, el flagelo no se forma. Cuando el flagelo se empieza a formar, el anillo MS (FliF) y el anillo C (FliG N-term + FliN + FliM) deben formarse en primer lugar o no formarán el flagelo. Eso parece un algo difícil de explicar a través de mecanismos evolutivos.

 ¿Acaso todo el proceso evolutivo sería más fácil si FliG ya estuviese unida a FliF? ¿Si FliG originalmente evolucionara junto a FliF? Porque entonces ya tendríamos la afinidad específica para el monómero de filamento y el filamento flagelar ya podría ser producido ¿verdad? Pero entonces, ¿cómo es que motA/B se unirian a FliG de una forma benéfica? Un buen número de residuos específicos tienen que ser alineados a la perfección para que la fuerza protón-motriz de motA/B  sea transferida a FliG como fuerza de torca.

En fin, de cualquier manera en que uno lo mira entiende que es mucho lo que se necesita para que se vinculen FliF con FliG. ¿Qué tan útil sería que la FliG tenga afinidad especifica por la flagelina si no estuviera unida a la FliF primero? ¿De qué serviría que la FliG tenga afinidad específica por el componente motA/B  si no estuviera anclada a motA/B primero? La adquisición de estas afinidades implicará numerosas diferencias adicionales en la posición de los residuos aminoacídicos a partir de las "proto" formas. Y lo más probable es que estas diferencias requeridas no serían secuencialmente beneficiosas de manera que la selección natural pueda guiar su puesta a punto.

Además, no esperemos que cierto grado de unión no-covalente vaya a suceder entre FliG y FliF con sólo una o dos posiciones de residuos correctas en lugar de las 46 posiciones de residuos bastante específicos que son usados para unir FliG con FliF en los flagelos modernos. Para superar los efectos de embate del movimiento browniano, el flagelo tiene que girar muy rápidamente (~100-300 rotaciones/segundo durante 3-4 segundos). Esto significa que una gran cantidad de inercia y fuerza de cizallamiento debe ser superada para mantener conectada a FliG con FliF. Un número significativo de los 46 residuos de que intervienen en el anclaje ("de tipo cerrojo") tendría que estar en su posición, todos al mismo tiempo, con el fin de superar estas fuerzas de cizallamiento en cualquier grado seleccionable. De hecho, se sugiere por experimentos de deleción que sólo el segmento N-terminal 4 de la FliG puede sufrir cambios significativos sin que haya una pérdida completa de la motilidad. Las mutaciones en los primeros 3 segmentos N-terminal (~30 aa.) dieron como resultado una pérdida completa de la motilidad —obviamente debido a que no hay la suficiente resistencia de unión a la FliF y/o una deficiencia de la capacidad de contribuir en la formación del flagelo. [10]

Sin embargo, da la casualidad de que los genes para las proteínas FliF y FliG están situados uno al lado del otro en el genoma. Ciertas mutaciones de deleción entre FliG y FliF han resultado en una sola proteína fusionada, una proteína FliG/FliF unida covalentemente que de hecho funciona bastante bien. Es evidente que un enlace covalente es mucho más fuerte que una unión no-covalente, por lo que se elimina la necesidad de tener decenas de uniones no-covalentes colocadas en la posición adecuada. Aunque la proteína de fusión unida covalentemente no funciona tan bien como el sistema de tipo silvestre que no está unido covalentemente, funciona lo suficientemente bien como para realizar el trabajo.

Debido a esta capacidad de la FliG de unirse de forma covalente con FliF algunos me han dicho que esto hace que sea fácil de lograr que los dos sub-sistemas (el motor y el rotor) se unan para dar lugar al super-sistema  que cumple la función de la motilidad flagelar. Esto no es así debido a la necesidad de la FliG de cumplir múltiples roles en ambos sistemas al mismo tiempo —como se describe anteriormente.

Experimentos mutagenicos realizados en FliF muestran que es necesario un "corto tramo C-terminal" de 9 residuos de aminoácidos "esenciales" para que el proceso de "construcción del flagelo" pueda darse. Tenga en cuenta que este proceso de montaje ocurre en el momento en que el motor está apagado y no hay rotación de la FliG. Los autores afirman que: "La eliminación o sustitución de hasta 10 aminoácidos inmediatamente por encima de la región esencial dieron como resultado un flagelo paralizado." [11] Eso suena como si fuese bastante específica. Los autores dijeron que la eliminación o sustitución de 10 residuos adicionales resultaron en parálisis flagelar. Parece, pues, que la rotación flagelar requiere algo estructuralmente específico además de lo que se requiere para la construcción flagelar. Un total de aproximadamente 19 aa bastante especificados de la proteína FliF necesita estar en su lugar, tanto para la construcción del flagelo como para que la motilidad pueda hacerse realidad.



Autor: Sean D. Pitman. Estudio en la Escuela de Medicina de Loma Linda University durante 1993-1997. Hizo su residencia en patología en el Centro Médico de Loma Linda University entre 2001-2005, y posteriormente trabajó en el área de hematología en City of Hope National Medical Center, durante 2005-2006. Tiene diversas publicaciones científicas.  

Traductor: Daniel Alonso - Estudia Licenciatura en Ciencias Biológicas en la UNT, Argentina.



REFERENCIAS:

[1] Nicholas Matzke, Evolution in (Brownian) space: a model for the origin of the bacterial flagellum, talkreason.org, 2003 ( http://www.talkreason.org/articles/flagellum.cfm )

[2] Anand Sukhan, Tomoko Kubori, James Wilson, y Jorge E. Galin. 2001. Genetic Analysis of Assembly of the Salmonella enterica Serovar Typhimurium Type III Secretion-Associated Needle Complex. J. Bacteriology 183: 1159-1167.

[3] Macnab, R. M., 1999. The bacterial flagellum: reversible rotary propellor and type III export apparatus. J Bacteriology. 181 (23), 7149-7153.

[4] He, S. Y., 1998. Type III protein secretion in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Reviews in Phytopathology. 36, 363-392.

[5] Kim, J. F., 2001. Revisiting the chlamydial type III protein secretion system: clues to the origin of type III protein secretion. Trends Genet. 17 (2), 65-69.

[6] Plano, G. V., Day, J. B. and Ferracci, F., 2001. Type III export: new uses for an old pathway. Mol Microbiol. 40 (2), 284-293.

[7] Nguyen, L., Paulsen, I. T., Tchieu, J., Hueck, C. J. and Saier, M. H., Jr., 2000. Phylogenetic analyses of the constituents of Type III protein secretion systems. J Mol Microbiol Biotechnol. 2 (2), 125-144.

[8] Macnab, R. M., Science 290, p. 2087

[9] Macnab R. M., Bacteria create natural nanomachines, USA Today, 2005 (http://www.USAtoday.com/weather/science/aaas/flagella121500.htm)

[10]May Kihara, Gabriele U. Miller, and Robert M. Macnab, Deletion Analysis of the Flagellar Switch Protein FliG of Salmonella, J. Bacteriol. 2000 June; 182(11): 3022-3028. (http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=94485)

[11] Bjorn Grunenfelder, Stefanie Gehrig, and Urs Jenal,Role of the Cytoplasmic C Terminus of the FliF Motor Protein in Flagellar Assembly and Rotation, Journal of Bacteriology, Mar. 2003, p. 1624-1633 Vol. 185, No. 5 (http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=148050&blobtype=pdf )

[12] Todas las animaciones presentadas en este ensayo son fruto del esplendido trabajo de Keiichi Namba et al. del ERATO Protonic NanoMachine Project (http://www.npn.jst.go.jp/index.html)

[13] Mis agradecimientos a Mike Gene por la excelente información  dada sobre el falgelo bacteriano en este website: (http://www.idthink.net/)

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